細胞轉染技術原理及應用

摘要： 講述細胞轉染技術分類,并分別介紹各種轉染方法的原理、應用、特點,及各種轉染方法的比較.       常規(guī) 轉染 技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,一類是穩(wěn)定轉染.前者外源 DNA /RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天,多用于 啟動子 和其它調(diào)控元件的分析.一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72小時內(nèi)（依賴于各種不同的構建）分析結果,常常用到一些報告系統(tǒng)如 熒光蛋白 ,β半乳糖苷酶等來幫助檢測.后者也稱穩(wěn)定轉染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體（episome）存在.盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標記,如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因）,潮霉素B磷酸轉移酶（HPH）,胸苷激酶（TK）等反復篩選,得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系.

轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大,許多轉染方法需要優(yōu)化DNA與轉染試劑比例,細胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測時間等.一些傳統(tǒng)的轉染技術,如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法, 脂質(zhì) 體法各有利弊,其主要原理及應用特點如下：

轉染方法    原理   應用   特點

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA復合物吸附 細胞膜 被細胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉染

瞬時性轉染 不適用于原代細胞

操作簡便但重復性差

有些細胞不適用

DEAE-右旋糖苷法

帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內(nèi)吞 瞬時性轉染 相對簡便、結果可重復  但對細胞有一定的毒副作用   轉染時需除血清

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導入 穩(wěn)定轉染  瞬時性轉染

所有細胞 適用性廣但細胞致死率高,DNA和細胞用量大, 需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件

病毒 介導法

通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 穩(wěn)定轉染 可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內(nèi)細胞等

逆轉錄病毒

特定宿主細胞 但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期   需考慮安全因素

腺病毒 通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 瞬時轉染  特定宿主細胞 可用于難轉染的細胞

需考慮安全因素

陽離子 脂質(zhì)體 法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內(nèi)吞 穩(wěn)定轉染 瞬時性轉染

所有細胞 適用性廣,轉染效率高,重復性好,但轉染時需除血清.轉染效果隨細胞類型變化大

Biolistic顆粒傳遞法

將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞,DNA在胞內(nèi)逐步釋放,表達 瞬時性轉染 可用于：人的表皮細胞,纖維原細胞, 淋巴細胞 系以及原代細胞

顯微注射法

用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩(wěn)定轉染  瞬時性轉染 轉染細胞數(shù)有限

多用于工程改造或 轉基因 動物的胚胎細胞

各種轉染方法的比較：

除上述傳統(tǒng)方法外,近年來上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術,以其適用宿主范圍廣,操作簡便,對 細胞毒性 小,轉染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉染性能Z佳,但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性,且其合成工藝復雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個碳個原子,即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子,使得聚合物網(wǎng)絡在任何pH下都能充當有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體.這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞,其效果好于脂質(zhì)聚酰胺,經(jīng)進一步的改性后,其轉染性能好于樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低.大量實驗證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設計更復雜的基因載體時,PEI經(jīng)常做為核心組成成分.

線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些,過去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低,有利于細胞定位,因此與BPEI相比應該轉染效率高一些.但近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物,從而提高轉染效率,但同時細胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低,但轉染效率卻較高.

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián),合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性,因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的 納米顆粒 ,從而提高轉染效率,當所形成復合物進入細胞以后,其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內(nèi)水解,使交聯(lián)聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI,這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性,其可降解性對體內(nèi)應用也具有重要的意義.

線性PEI——一種高效的陽離子聚合物轉染試劑

轉染效率更高，細胞毒性更低。線性PEI廣泛適用于常見細胞系，如：HEK-293、HEK293T、Hep G2、Hela、CHO-K1、COS-1、COS-7、HIH/3T3和sf9等，PEI即使在有血清存在的情況下仍然能夠高效的將核酸導入細胞，其具有*的轉染效率，重組蛋白的高表達水平，且與含血清的培養(yǎng)基相兼容，低細胞毒性，PEI的另外一個顯著優(yōu)勢是較其他轉染試劑使用成本極低。

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